本公司生产的 Cas9 Nuclease (SpCas9)，即 CRISPR-associated endonuclease Cas9 也称 Csn1，是本公司自主研发的技术平台表达、纯化获得 的一种来源于 Streptococcus pyogenes，能在 gRNA 引导下序列特异性地切割双链 DNA 的核酸内切酶。本产品可以用于体外筛选高效的 guide RNA (gRNA)序列、特定 DNA 序列在 gRNA 引导下的剪切、含有特定序列的双链环形 DNA 的线性化等用途。CRISPR/Cas9 是一项突破性的基因组 编辑技术，操作便捷，应用广泛。CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是一种原核生物利用 RNA 引导的 DNA 核酸酶 Cas9 对外源的噬菌体或病毒核酸进行基因沉默的获得性免疫系统(adaptive immune system)，后续在此基础上逐渐发展为广泛应用于原 核和真核生物的越来越成熟的基因编辑技术。该技术能够在 gRNA 引导下通过 Cas9 对原核和真核生物的基因组 DNA 的靶向序列进行位点特异性 的切割，然后通过易错修复(error-prone repair)或同源重组(homologous recombination)在切割位点改变或插入序列来产生移码突变，从而通过 基因编辑而实现基因敲除。其中 gRNA 确保识别位点的特异性。随着 CRISPR 技术的发展，该技术目前不仅可以实现基因敲除，还可以实现基因的 点突变、插入突变等多种突变方式，特别是在临床应用方面可以用于修复不良突变等。同时通过构建没有内切酶活性的 Cas9 突变体 dCas9，通过 与 dCas9 直接融合表达或间接招募转录激活或转录抑制因子，可以实现 sgRNA 靶向基因的转录激活或转录抑制。 

纯度（Purity）：不含 DNA 外切酶，不含非 gRNA 依赖的 DNA 内切酶，不含 RNA 酶。

组分和说明

产品应用 

体外筛选高效 gRNA 序列、特定双链 DNA 在 gRNA 引导下的剪切、含有特定序列双链 DNA 的选择性线性化等。 

产品优势 

Cas9 Nuclease 可与向导 RNA（gRNA）形成稳定的核糖核蛋白（RNP）复合物，进入细胞核后实现高效的基因组 DNA 切割。 在多种细胞系（包括标准细胞系、免疫细胞、原代细胞和干细胞）中表现出稳定的高编辑效率。

使用说明

1.溶解并混匀体外消化反应所需的各种溶液。将 Cas9 Nuclease、gRNA、底物 DNA 置于冰浴上，使用无核酸酶水稀释 gRNA 至 300nM， 底物 DNA 至 30nM。 

2.按照下表配制反应体系(以 30μl 体系为例)：

3.用移液器轻轻吹打混匀或轻微 Vortex 混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。25℃预孵育 10min。

4.加入 3μl 30nM 底物靶 DNA (30μl 最终体积)，轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀 液体，37℃孵育 15min，反应时间可以根据实际情况适当延长至例如 30-120min。 

5.每个样品中加入 1μl 蛋白酶 K，轻轻混匀， 室温孵育 10min。 

6.每个反应体系中加入 6μl DNA 上样缓冲液(6X)，然后使用适当浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分析。如果不立即电泳，可以-20℃保存备用。 

常见问题：

 1.为什么观察到目的 DNA 切割不完全? a.可能是由于 Cas9 Nuclease、sgRNA、target DNA 的比例不合适引起的，推荐 Cas9 Nuclease、sgRNA、target DNA 的摩尔比例至 少为 10:10:1。也可以通过适当延长反应时间使反应更加充分。 

b.可能与 sgRNA 的序列有关，可以根据 target DNA 选择更合适的 sgRNA 序列，不同的 sgRNA 的效果会差别比较大。 

c.可能由于 sgRNA 降解引起的，可以通过凝胶电泳验证 sgRNA 的完整性。

保存条件： 

-20℃保存，≤0℃运输 

注意事项： 

（1）本产品使用时会涉及 gRNA 和 DNA 的操作，必须注意 RNase-free 和 DNase-free 的相关操作。所有自行准备的试剂和耗材也都应是 Nuclease-free 的。如果可能有核酸酶污染，可考虑用 0.01%的 DEPC 处理过夜，然后高温高压处理后使用。操作时建议戴一次性口罩操作。 

（2）对于操作环境中核酸酶的去除，推荐使用阿拉丁生产的 RNase and DNase Away (R749971) 以去除实验桌、仪器设备等表面或其它接触面上的 核酸酶。反应体系中推荐加入 RNase Inhibitor 以保护 RNA 不被降解。 

（3）本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。 

（4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。