TEV Protease是一种在大肠杆菌中重组表达的同时带有GST标签和His标签(6X His tag)的烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus, TEV)的半胱氨酸蛋白酶，能特异性地识别七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser，并在Gln和Gly/Ser氨基酸残基之间进行酶切，常用于去除融合蛋白的Glutathione S-transferase 、His或者其它标签的蛋白酶。 建议把GST或His等标签设计在融合蛋白的N端，并在GST或His等标签与目的蛋白之间设计加入TEVProtease专一性识别与酶切的上述七肽序列。这样在GST或His标签被酶切后，在目的蛋白的N端仅有一个额外的Gly/Ser氨基酸残基，从而最大限度地减少了对目的蛋白结构和功能的影响。构建含有TEVProtease专一性识别位点的目的蛋白表达质粒，可以考虑选购阿拉丁的质粒pET-N-His-TEV。 TEVProtease的**酶切温度是30℃，在29-34℃范围内均具有较高的酶活性，但当温度达到或高于高37℃时，其酶活性会急剧下降。在实际操作过程中，为尽量保留目的蛋白的结构和生物活性，建议在4℃用TEVProtease酶切过夜。TEVProtease在pH6.0-9.0范围内具有活性，而当pH小于或等于5时，会失去酶活性。 TEVProtease还有一个突出的优点是在400mM咪唑中仍有较高活力，因此对于很多用镍柱纯化的His标签目的蛋白，可直接将TEVProtease加入含高浓度咪唑的刚刚纯化的目的蛋白溶液中，在4℃边透析去除咪唑边进行酶切。当然也可以在透析后再用TEVProtease进行酶切以去除His标签。经过酶切的目的蛋白，溶液中带有His标签的本TEVProtease以及切除下来的His标签，都可以通过与镍柱结合而去除。His标签蛋白的纯化可以考虑选购阿拉丁的His-tagPurificationResin(耐还原螯合型) 或His标签蛋白纯化试剂盒(耐还原螯合型)以及阿拉丁的 His-tag Purification Resin (耐变性剂型) 或His标签蛋白纯化试剂盒(耐变性剂型) 。 TEV Protease的酶活性不会被常见的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhiibtor)如PMSF、AEBSF、bestatin、pepstatin、E-64、TLCK和EDTA所抑制。但靶向半胱氨酸(Cysteine)残基的蛋白酶抑制剂如NEM或IAA等，可以显著抑制TEV Protease的酶活力，因为天然的TEV Protease含有其维持酶活力所必需的Cys151。 阿拉丁TEV Protease 比较适用于酶切带His标签的蛋白，因为酶切后没有完全酶切的重组蛋白蛋白、切除下来的His 标签以及TEV Protease 都可以结合于镍柱上而被除去，穿柱液中则含有所需的靶蛋白；阿拉丁TEV Protease 同样比较适用于酶切带有GST标签的重组蛋白，因为酶切后没有完全酶切的重组蛋白、切除的GST标签以及TEV Protease 都可以结合于GST纯化介质上而被除去，穿柱液中则含有所需的靶蛋白。 TEV Protease 与P2307 TEV Protease (His-tag)相比，最大的优点是不仅适合用于酶切去除带有TEV酶切位点的His标签，同时适合用于切除带有TEV酶切位点的GST标签。 酶活性单位定义：30℃，pH8.0条件下反应1小时，能够切割3μg对照底物达85%以上所需的酶量为一个活性单位。 阿拉丁TEV Protease 酶活性鉴定结果可参考图1。 图1.TEV Protease 切割GST标签蛋白的效果图。含有TEV Protease识别位点的76kD GST标签蛋白与TEV Protease进行反应，底物的用量为3μg，酶的用量依次为0、0.1、0.25、0.5、0.67、1、2U，30°C在1X TEV Buffer中反应1小时后取样进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色。酶切产物大小为约50kD的目的蛋白和约26kD的GST标签。 TEVProtease分子量大小约28kDa，纯度：≥95%。 TEVProtease储存液组成为：25mMTris-HCl, 150mMNaCl, 1mMEDTA, 5mMDTT, 50%(v/v)甘油, pH8.0。 10XTEVBuffer组成为：500mMTris-HCl, 500mMNaCl, 5mMEDTA, 10mMDTT, pH8.0。 本产品每毫升含有1000单位的酶，可用于约3mg带有TEV Protease识别位点的融合蛋白的切割。