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产品简介

本试剂盒在普通碱裂解法的基础上进行了改进，玻璃珠可以有效的破除酵母细胞壁，新型硅基质膜和缓冲液系统能高效专一的结合质粒DNA，同时可以最大限度去除蛋白及其他杂质，整个过程方便快捷，不需使用有毒有害试剂，可以同时处理多个样品。除适用于酵母细胞外，也可用于大肠杆菌。使用本试剂盒提取的质粒DNA可用于各种分子生物学实验，如连接、转化、测序和文库筛选等。

自备试剂：β-巯基乙醇、无水乙醇。

实验前准备及重要注意事项

1. 所有组分可在干燥、室温（15-30℃）环境稳定保存1年，将吸附柱置于2-8℃可保存更 长时间，加入RNase A的Buffer P1 置于2-8℃可稳定保存6个月。

2. **次使用前，将RNase A溶液全部加入到Buffer P1中，混匀，置于2–8℃保存。

3. **次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer PW中加入无水乙醇。

4. 使用前请检查Buffer P2、Buffer N3是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀现象，可在37℃水浴几分钟，即可恢复澄清。

5. 注意不要直接接触Buffer P2和Buffer N3，使用后应立即盖紧盖子。

6. 提取的质粒量与酵母菌株、质粒拷贝数、培养条件等因素有关，通常酵母质粒拷贝数都很低，通过电泳或分光光度计法都很难检测到。

操作步骤

1. 取1-5 ml酵母培养物（最多不超过5×107个酵母细胞，一般对于酿酒酵母OD =1.0 时，相当于1-2×107细胞/ml）加入离心管（自备）中，12,000rpm（~13,400×g）离 心30秒，收集菌体沉淀，尽量吸弃上清。

2. 向菌体中加入250 μl Buffer P1（请先检查是否已加入RNase A），重悬沉淀。

3. 在以上混合物中加入40  mg的玻璃珠（Glass  Beads），涡旋震荡10分钟。

4. 向离心管中加入250 μl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀6-8次，室温放置5-10分钟， 此时菌液应变得清亮粘稠。

注意：温和混匀，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片段。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。

5. 向离心管中加入350 μl Buffer N3，立即温和地上下颠倒混匀6-8次，此时出现白色絮状沉淀，12,000 rpm离心20分钟。

注意：Buffer N3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。

6. 柱平衡: 向已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中加入200 μl Buffer PS，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7. 将步骤5所得上清加入到已装入收集管的吸附柱中，注意不要吸出沉淀。

注意：吸附柱的最大容积为750 μl，溶液分2次过柱。

8．12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

9. 向吸附柱加入150 μl Buffer PB，12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

10. 向吸附柱中加入750 μl Buffer PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

11. 将吸附柱重新放回收收集管中，12,000 rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。

12.将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-100 μl Buffer EB， 室温放置数分钟，13,000 rpm离心1分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20℃保存质粒

注意：

1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置数分钟，13,000 rpm离心1分钟，将质粒溶液收集到离心管中。

2）质粒拷贝数较低或>10 kb时，Buffer EB在65-70℃水浴预热，可以增加提取效率。

3）通常酵母质粒拷贝数很低，通过电泳或者分光光度计法都很难检测到。提取的质粒如果用于下一步实验，通常建议使用量为：用作PCR模板可使用1–5 µl质粒，用于转化大肠杆菌可使用5–10 µl质粒。

4）转化大肠杆菌时应使用商业化高转化效率的感受态细胞。