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  • E. coli DNA Ligase
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  • E. coli DNA Ligase

    实验室试剂
    阿拉丁
    2000-5000
    • ￥252.90-3894.90
      ￥0.00
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商品参数
  • 所属类别:实验室试剂
  • 产品品牌:阿拉丁
  • 价格区间:2000-5000
商品描述


品牌货号


别名

阿拉丁E745500


大肠杆菌 DNA 连接酶

规格或纯度不含除E. coli DNA Ligase之外的其它种类的DNA连接酶，不含内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。
稳定性与储存-20℃保存，两年有效。
英文名称E. coli DNA Ligase
储存温度-20°C储存
运输条件超低温冰袋运输
产品介绍

阿拉丁生产的E. coli DNA Ligase，即大肠杆菌DNA连接酶，由阿拉丁自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的重组酶。E. coli DNA Ligase是一种以NAD+ (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)为辅酶，Mg2+', "依赖的，催化双链DNA中5'磷酸和3'羟基之间形成磷酸二酯键，即催化双链DNA粘性末端连接或双链DNA中的缺刻修复的DNA连接酶1]。E. coli'DNA Ligase可催化双链DNA相邻粘性末端5'磷酸和3'羟基磷酸二酯键的形成，但常规条件下不能进行平末端双链DNA的连接。在添加10-15% PEG和适当高浓度的单价阳离子时，也可以催化平末端双链DNA的连接反应。"E. coli DNA Ligase在一定温度范围内(4-37℃)均具有活性，同时可以被热失活(65℃孵育20分钟)。阿拉丁生产的E. coli DNA Ligase连接粘性末端双链线性DNA的效果请参考图1：图1. 阿拉丁生产的E. coli DNA Ligase连接粘性末端双链线性DNA的效果图。利用阿拉丁生产的EnzymoPure™ DNA Polymerase ，使用两端带有Hind III酶切位点的引物对靶基因进行PCR扩增，生成两种不同长度的两端带有HindⅢ酶切位点的平末端双链线性DNA分子(900bp和600bp)，随后使用阿拉丁Hind III 对PCR产物进行酶切，获得两端带有互补粘性末端的双链线性DNA分子，分别作为Substrate 1 (900bp)和Substrate 2 (600bp)；在20µl反应体系(30mM Tris-HCl, 4mM MgCl2, 1mM DTT, 26μM NAD, 50μg/ml BSA, PH8.0 @25℃)中，分别加入400ng经PCR扩增及Hind III酶切产生的两种双链DNA片段，以及图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的E. coli DNA Ligase，16℃孵育30分钟进行连接，然后65℃孵育20分钟以终止反应。取出10μl反应产物，加入2μl 6X DNA Loading Buffer ，然后进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。如图所示，本产品与N公司的产品相比，具有相当的连接粘性末端双链线性DNA的效果。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。


用途：

粘性末端双链DNA分子的连接；双链DNA的缺刻修复；cDNA第二链合成后的克隆[2]。


来源：

纯化自携带编码E. coli DNA ligase的E. coli重组菌株。


酶储存溶液：

10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 200µg/ml BSA, 50% Glycerol (pH7.4 @25℃)。10X Reaction Buffer: 300mM Tris-HCl, 40mM MgCl2, 260μM NAD, 10mM DTT, 500μg/ml BSA (pH8.0 @25℃)。


失活或抑制：

65℃孵育20分钟可使E. coli DNA Ligase失活。


注意事项：

10X Reaction Buffer建议长期保存于-80℃，以延长NAD半衰期。E. coli DNA Ligase需要以NAD (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸) 作为辅酶，而不是像T4 DNA连接酶等以ATP为辅酶。E. coli DNA Ligase对于平末端片段的连接效率是极低的，对于平末端的连接建议使用T4 DNA Ligase。E. coli DNA Ligase的催化底物是双链DNA分子，不能用于单链DNA或RNA的连接反应。E. coli DNA Ligase连接反应需要以NAD作为辅助因子，10X Reaction Buffer中含有辅助因子NAD，因此10X Reaction Buffer建议长期保存于-80℃，以延长NAD半衰期。本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。


使用说明：

1.参考下表在冰浴中配制反应体系(以20μl体系为例)： ReagentVolumeFinal ConcentrationdsDNAxμlup to 0.25μg/μl10X Reaction Buffer2μl1XE. coli DNA Ligase (10U/μl)1μl0.5U/μlNuclease-free Water(17-x)μl-Total Volume20μl-注1：如果同时进行多个反应，可把上表中除底物DNA之外的所有组分预先混合，然后再分装到各反应管。注2：E. coli DNA Ligase使用时宜存放在冰盒内或冰浴上。2.轻轻震荡混匀或移液器反复吹打混匀，随后低速离心以使粘附在管壁上的液体沉淀至管底。3.反应条件：16℃孵育30-60分钟。4.终止反应：反应结束后立即将反应产物在65℃条件下孵育20分钟，以终止反应。5.将反应后的产物进行琼脂糖凝胶或聚丙烯凝胶电泳，拍照观察并分析连接效果。如果需要从琼脂糖凝胶中回收DNA样品，推荐使用D0056 DNA凝胶回收试剂盒；如果需要从酶切消化反应体系中纯化DNA样品，推荐使用D0033 PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒。6.其他用途请自行参考E. coli DNA Ligase的相关文献资料进行。 常见问题：1.E. coli DNA Ligase和T4 DNA Ligase有什么区别？在推荐的使用条件下，E. coli DNA Ligase不能连接平末端DNA或RNA分子[3]。2.E. coli DNA Ligase能否被热失活?可以。将E. coli DNA Ligase在65℃条件下孵育20分钟，即可使其完全失活。3.应该选用哪种连接酶或连接试剂盒?如果需要平末端或粘性末端的快速连接，建议使用快速DNA连接试剂盒。T4 DNA Ligase 是大多数DNA重组反应所选用的酶，可用于粘性末端(室温10分钟连接)或平末端(室温2小时或过夜)的连接。E. coli DNA Ligase对底物的选择比T4 DNA Ligase更具有特异性，如果只需要粘性末端的连接，抑制平末端或RNA分子的连接，建议使用E. coli DNA Ligase。如果实验目的是单链DNA或RNA分子的连接，建议使用T4 RNA Ligase 


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