一、产品简介： 乙酰辅酶 A 是能源物质代谢的重要中间代谢产物，在体内能源物质代谢中是一个枢 纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶 A 汇聚成一条共同的代谢 通路--三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水，释放能 量用以 ATP 的合成。它也是合成脂肪酸、酮体、胆固醇及其衍生物等生理活性物质的 前体物质。 苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和 NAD+生成草酰乙酸和 NADH 。柠檬酸合酶可催化乙 酰辅酶 A 和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶 A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反 应，乙酰辅酶 A 含量和 NADH 的生成量成正比，340nm 下吸光值的上升量反应了乙 酰辅酶 A 含量的高低。 二、试剂盒的组成和配制： 试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 | 提取液 | 液体 100mL× 1 瓶 | 4℃保存 | / | 试剂一 | 液体 20mL× 1 瓶 | 4℃保存 | / | 试剂二 | 粉体 mg× 1 瓶 | -20℃保存 | 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 9mL 试剂一溶解备用。 | 试剂三 | 粉体 mg× 1 瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下或离心使试剂落入底 部，再加 9mL 试剂一溶解备用。 | 试剂四 | 粉体 mg× 1 支 | -20℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加 1. 1mL 蒸馏水溶解备用。 |
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三、所需的仪器和用品： 酶标仪、96 孔板、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 四、乙酰辅酶 A 含量测定： 建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！ 1 、样本制备： ① 组织样本： 称取约 0. 1g 组织样本，加 1mL 的提取液，进行冰浴匀浆，粗提液全部转移到 EP 管 中，12000rpm ，4℃离心 10min ，上清液待测。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5~ 10 的比例提取。 2 、上机检测： ① 酶标仪预热 30min ，设定波长至 340nm。 ② 试剂解冻至室温（25℃) , 在 96 孔板中依次加入: | 试剂名称(μL） | 测定管 | | 样本 | 20 | | 试剂二 | 85 | | 试剂三 | 85 | | 混匀，室温（25℃) 下，5min 后于 340nm 处读取 A1 值。 | 混匀，室温（25℃) 下，5min 后于 340nm 处读取 A1 值。 | | 试剂四 | 10 | | 混匀，室温（25℃) 下，反应 10min 后 于 340nm 处读取吸光值 A2，ΔA=A2-A1。 | 混匀，室温（25℃) 下，反应 10min 后 于 340nm 处读取吸光值 A2，ΔA=A2-A1。 |
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五、结果计算： 1 、按照样本质量计算： 乙酰辅酶 A 含量(nmol/g 鲜重)=[ΔA÷ε÷d ×V2× 109]÷(W×V1÷V)=3215×ΔA÷W ε---NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm； d---96 孔板光径，0.5cm； V---提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，20μL=0.02mL； V2---反应体系总体积，200μL=2 × 10-4L；W---样品质量，g。 | 
