阿拉丁生产的PBCV-1 DNA Ligase，即PBCV-1 DNA连接酶，也被称为PBCV DNA Ligase、SplintR™连接酶或Chorella'virus DNA连接酶，是一种ATP依赖的DNA连接酶，能够高效催化与一条互补的RNA单链配对的两条相邻DNA单链的连接反应。这两条相邻的DNA链中，提供3'羟基的被称之为受体DNA链，提供5'磷酸的被称之为供体DNA链(Donor DNA)；在这个连接过程中需要一条互补的RNA链对两条DNA单链起“夹板”或“支架”的作用。PBCV-1 DNA Ligase在连接点处可以耐受多种碱基对的组合，但当5'端磷酸化的Donor DNA与“夹板”RNA所形成的**个碱基对是dC/G和dG/C时会产生部分抑制，当Donor DNA预“夹板”RNA所形成的第1和第2个碱基对都是dC/G或dG/C碱基对时，酶活性会被更进一步被抑制。5'磷酸化的Donor DNA的**个碱基为dA或dT时连接效率较高；3'端羟基化的Acceptor DNA的**个碱基为dT时连接效率较高。该酶对于通过RNA“夹板”介导固定的DNA底物具有比T4 DNA ligase更强的亲和力(Km = ~1nM），和随后的PCR、qPCR或滚环扩增(rolling circle amplification)等技术相结合，能够实现在复杂的混合物中超高灵敏度检测到低于纳摩尔级的特定目标RNA。PBCV-1 DNA Ligase的这种活性使得该酶可以用于包括各种SNP的miRNA、mRNA和非编码RNA的定性或定量检测，以及用于二代测序(next-generation sequencing)和分子诊断(molecular diagnostics)。PBCV-1 DNA Ligase对ATP的浓度要求比较宽泛，ATP浓度为10µM-1mM时都可以有效发挥作用；对pH的耐受也比较高，在pH6.5-pH9的范围内都能很好发挥作用。通常，当Mg2+的浓度大于5mM、pH在7.5-8.0之间时，PBCV-1 DNA Ligase具有较高的活性。该酶的活性可以通过提高反应温度至37℃，补充5mM Mn2+而得以增强；但当反应体系中的盐离子浓度超过100mM时，该酶活性即被抑制。阿拉丁生产的PBCV-1 DNA Ligase催化连接与互补RNA链退火的相邻DNA单链的效果参考图1。图1.阿拉丁生产的PBCV-1 DNA Ligase与同类产品(Competitor)催化连接与互补RNA链退火的相邻DNA单链的效果图。为了更直观的观察到PBCV-1 DNA Ligase的连接效果，本实验利用阿拉丁生产的Thermostable RNase H 催化降解连接产物中的互补RNA链，以便于电泳时可以清晰观察到连接的DNA (ligated DNA)的电泳效果。在20µl反应体系(50mM Tris-HCl pH7.5, 10mM MgCl2, 1mM ATP, 10mM DTT)中，加入通过退火产生的2µM的RNA:DNA杂交链，以及图中指定量的本产品或N公司(Competitor)的PBCV-1 DNA Ligase，25℃孵育15min进行连接反应，连接反应结束之后置于冰上3min，取出10µl反应液加入10U的Thermostable RNase H 65℃孵育20min以终止连接反应并同时消化互补的RNA单链。取出5μl消化后的产物，加入1μl 6X DNA Loading Buffer，95℃变性5min，然后进行7M Urea+15%聚丙烯酰胺凝胶电泳。室温条件下用1X TBE作为电泳液,180V电泳75min；NA-Red溶液(2000:1) 室温染色15min，凝胶成像仪拍照观察。如图所示，本产品与N公司的产品相比，具有类似的催化与互补RNA链退火的相邻DNA单链进行连接的效果。