产品内容 | R669890 | Component | 50 T | Storage | | R669890A | DNase I | 1000 U | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | R669890B | 10×Reaction Buffer | 1mL | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | R669890C | Buffer RL | 35 mL | RT | | R669890D | Buffer RW1 | 40 mL | RT | | R669890E | Buffer RW2 (concentrate) | 11 mL | RT | | R669890F | RNase-Free Water | 10 mL | RT | | R669890G | Spin Columns FL with Collection Tubes | 50 sets | RT | | R669890H | Spin Columns RM with Collection Tubes | 50 sets | RT | | R669890I | RNase-Free Centrifuge Tubes (1.5 mL) | 100 EA | RT |
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产品简介 本试剂盒采用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲系统，可从细菌或培养的动物细胞中快速提取总RNA。30-40分钟内即可完成反应，提取的总RNA纯度极高，没有蛋白质和其他污染，适用于RT-PCR、Real-Time RT-PCR、芯片分析、体外翻译等实验。 自备试剂：Lysozyme、β-巯基乙醇、无水乙醇（新开封或提取RNA专用）。 实验前准备及重要注意事项 1. 预防RNase污染，应注意以下几方面： 1） 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。 2） 配制溶液应使用无RNase的水。 3） 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。 2. Buffer RL在使用前请加入β-巯基乙醇至终浓度为1%，如1 ml Buffer RL加10 μl β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的Buffer RL 4℃可保存1个月，如出现沉淀，请加热溶解后使用。 3. **次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。 4. 如未特殊说明，所有离心步骤均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。 操作步骤 1．4℃ 12,000 rpm（~13,400×g）离心2分钟收集菌体（菌体量最大不超过1×109）， 小心去除所有上清。 注意：上清如果有残留，会影响后续的消化过程。 2. 用含有Lysozyme的100 μl TE缓冲液彻底重悬菌体，室温孵育。具体配方和孵育时间如下： | / | TE缓冲液中Lysozyme的终浓度 | 孵育时间 | | G-细菌 | 400μg/ml | 3-5分钟 | | G+细菌 | 3mg/ml | 5-10分钟 |
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3. 加入350μl Buffer RL（使用前请检查是否加入β-巯基乙醇），涡旋震荡混匀（此步骤可能出现不溶性沉淀），将溶液与沉淀全部加入到已装入收集管的过滤柱（Spin Columns FL）中，12,000 rpm离心2分钟。 4. 向上步得到的滤液中加入250μl无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入已装入收集管的吸附柱（Spin Columns RM）中，12,000 rpm 离心1分钟，弃掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。 5. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，12,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。 6. 配制DNase I 混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8 μl 10×Reaction Buffer和20 μl DNase I（1 U/μl），混匀， 配制成终体积为80 μl的反应液。 7. 向吸附柱中直接加入80 µl DNase I 混合液，20-30℃孵育15分钟。 8. 向吸附柱中加入350 μl Buffer RW1，12,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。 9. 向吸附柱中加入500 μl Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）, 12,000 rpm离心1分钟,弃废液。 10. 重复步骤9。 11. 将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm离心2分钟。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。 12.将吸附柱装入新的RNase-Free的收集管中，向吸附膜的中间加入30-50 μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。 注意：1） RNase-Free Water体积不应小于30 μl，体积过小影响回收率。 2） 如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重复步骤12。 如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤12。 | 
