miRNA提取试剂盒专用于从各种动物组织、植物组织、细胞、血清、血浆等样本中分离纯化miRNA，还可以提取siRNA，snRNA等其他小于200 nt的小分子RNA，同时也可用于总RNA的提取。本品将酚/胍裂解技术和硅基质膜纯化技术相结合，独特的裂解液在有效抑制RNases的同时，可以通过有机抽提的方法除去细胞或组织样品中的大部分DNA和蛋白。对于一些敏感的下游实验中，如需富集miRNA可适用该试剂盒单独对miRNA进行富集。本品适用样本范围广，制备的RNA纯度高，可直接用于敏感的下游应用，如Northern Blot分析，Real-Time PCR，Microarray Analysis等。

自备试剂：

氯仿、无水乙醇（新开封或提取RNA专用）。  

实验前准备及重要注意事项：

1．预防RNase污染，应注意以下几方面： 

1）使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。 

2）玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸 泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。 

3）配制溶液应使用无RNase的水。 

4）操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。 

2．提取的样品避免反复冻融，否则影响miRNA提取的量和质量。 

3．**次使用前应按照试剂瓶标签说明在Buffer RWT和Buffer RW2中加入无水乙醇。 

4．所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。

操作步骤：

Protocol A：miRNA富集 （可直接用于敏感的下游实验） 

1．样品处理 

1a. 组织：将组织在液氮中磨碎。每30-50 mg组织加1 ml TRIzon Reagent，震荡混匀。样 品体积不超过TRIzon Reagent体积的十分之一。 

1b. 单层培养细胞：吸去培养液，加入TRIzon Reagent，每10 cm2 加入1 ml TRIzon Reagent （裂解液用量视培养瓶面积而定）。  

1c. 细胞悬液：离心得到细胞沉淀，弃上清。每5×106 -1×107 细胞加入1 ml TRIzon Reagent （细胞不需洗涤）。 

1d. 血浆或血清：取200 μl血浆或血清样本，加入5倍体积TRIzon Reagent，震荡混匀30秒。 

2．样品中加入TRIzon Reagent后反复吹打几次，使其充分裂解。室温放置5分钟，使 蛋白核酸复合物完全分离。 

3．可选步骤：4℃ 12,000 rpm（~13,400×g）离心5分钟，取上清，转入一个新的离心 管（自备）中（如样品中含较多蛋白、脂肪、多糖等，可选做此步骤）。 

4．向上清中加入氯仿，每使用1 ml TRIzon Reagent加入200 μl氯仿，盖好管盖，剧烈 振荡15秒，室温放置5分钟。 

5．4℃ 12,000 rpm离心15分钟，样品分为三层：红色有机相，中间层，无色水相，将 上层无色水相移到一个新的离心管（自备）中。 

6．向步骤5得到的溶液中加入1/3倍体积的无水乙醇， 混匀，将得到的溶液和沉淀一起 转入已装入收集管的吸附柱RM（Spin Columns RM）中。若一次不能将全部溶液加 入吸附柱，请分多次转入。12,000 rpm离心30秒，离心后弃掉吸附柱RM，保留流 出液。 

7．向步骤6得到的溶液中加入2/3倍体积的无水乙醇，混匀。 

8．将上步所得溶液和沉淀一起转入已装入收集管的吸附柱RS（Spin Columns RS）。 若一次不能将全部溶液加入吸附柱，请分多次转入。12,000 rpm离心30秒，倒掉收 集管中废液，将吸附柱RS重新放回收集管中。 

9．向吸附柱RS中加入700 μl Buffer RWT（使用前检查是否加入无水乙醇），12,000 rpm离心 30秒, 倒掉收集管中的废液，将吸附柱RS重新放回收集管中。 

10.向吸附柱RS中加入500 μl Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）, 12,000 rpm离心 30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱RS重新放回收集管中。 

11.重复步骤10。 

12.12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱RS置于室温数分钟，以彻 底晾干。 注意：此步骤的目的是将吸附柱RS中残留的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、 PCR等）。 

13.将吸附柱RS置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱中间部位加入30-50 μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，得 到的RNA溶液保存在-70℃，防止降解。

注意：

1）RNase-Free Water体积不应小于30 μl，体积过小影响回收率。 

2）如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重复步骤13。 

3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱RS中，重复步骤13  

Protocol B：总RNA的提取（提取的总RNA包括miRNA等其他<200 nt的小分子RNA） 1~5步骤同protocol A。 

6．向步骤5得到的溶液中加入1.25倍体积的无水乙醇，混匀。 

7．将上步所得到的溶液和沉淀一起转入已装入收集管的吸附柱（Spin Columns RM）中。 若一次不能将全部溶液加入吸附柱RM中，请分多次转入。12,000 rpm离心30秒，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱RM重新放回收集管中。 

8．向吸附柱RM中加入700 μl Buffer RWT（使用前检查是否加入无水乙醇）, 12,000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱RM重新放回收集管中。 

9．向吸附柱RM中加入500 μl Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）, 12,000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱RM重新放回收集管中。 

10.重复步骤9。 

11.12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱RM置于室温数分钟，以彻 底晾干。 

注意：此步骤的目的是将吸附柱RM中残留的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、 PCR等）。 

12.将吸附柱RM转入新的无RNase离心管中，向吸附柱中间部位加入30-50 μl RNase-Free Water，室温放置1分钟，室温 12,000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，得到的RNA溶液 保存在-70℃，防止降解。 

注意：

1）RNase-Free Water体积不应小于30 μl，体积过小影响回收率。 

2）如果要提高RNA的产量，可用30-50 μl新的RNase-Free Water重复步骤12。 

3）如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱RM中，重复步骤12。