产品简介

本产品是专为两步法RT-PCR**步实验配制的cDNA**链合成试剂盒。该试剂盒中使用的HiFiScript逆转录酶是M-MLV由来的新型高效逆转录酶，新颖突变位点大幅提升酶的转录活性，cDNA**链合成的效率和产量更高，可利用pg级的总RNA或mRNA合成cDNA**链。点突变消除RNase H活性，酶的延伸性能提高，有效改善逆转录酶与RNA模板的亲和力，可获得长至12 kb的cDNA。精心优化的RT Buffer使逆转录酶应用范围更广，对后续的PCR以及定量PCR实验兼容性高。该试剂盒配备所有逆转录试剂，使用简单方便。适用于**链cDNA的合成和后续的RT-PCR、RT-qPCR，以及全长cDNA文库的构建等。 

产品特点

1．高效的逆转录效率：新颖突变位点大幅提升酶活性能，获得更高产量的cDNA。 

2．良好的延伸能力：点突变消除RNase H活性，改善逆转录酶与RNA模板的亲和力，可获得长至12 kb的cDNA。 

3．灵敏度高：可利用pg级的总RNA或mRNA模板合成cDNA**链。 

4．使用方便：逆转录试剂盒中已配备所有逆转录试剂，仅需准备模板即可轻松完成逆转录。

注意事项

1．在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套。 

2．实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。 

3．本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。 

4．若起始RNA的量小于50 ng，建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。

使用方法 

注意：1 ng-5 μg总RNA可建立20 μl反应体系，如果总RNA量大于5 μg，请按比例扩大反应体系。 

i 逆转录操作步骤： 

1．将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFiScript和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。 

2．根据以下表格配制反应体系，总体积为20 μl。

注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。

2）Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配制而成。

3．涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 

4．cDNA合成反应条件： 

1）若下游进行荧光定量PCR检测，42℃孵育15分钟，85℃孵育5分钟。 

2）若下游进行普通PCR检测，42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。 

注意：对于二级结构复杂或GC含量高的模板，可以提高逆转录温度至50℃，增强逆转录效率。 

5．反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。 

6．逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。

ii 若逆转录效率低，或RNA模板二级结构复杂、GC含量高时，建议采用以下步骤： 

1．将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFiScript和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。 

2．根据以下表格配制反应体系，总体积为13 μl 。

3．70℃孵育10分钟，迅速冰浴2分钟。 

4．短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 

5．继续向以上反应液中加入以下试剂：

注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。

2）Primer Mix由Oligo（dT）和Random primer配制而成。

6．进行cDNA**链合成： 

1）若下游进行荧光定量PCR检测，50℃孵育15分钟，85℃孵育5分钟。 

2）若下游进行普通PCR检测，50℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。 

7．反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。 

8．逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，加入量应小于PCR反应体系的1/10，或置于-20℃长期保存。