产品简介

本试剂盒适用于从革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌中提取高纯度总DNA，每次可处理106-108个细胞，获得多至20 μg的总DNA。纯化过程中不需苯酚或氯仿等有毒溶剂， 无需乙醇沉淀，一小时内即可获得高纯度DNA。本试剂盒采用优化的缓冲体系使裂解液中的DNA高效特异的结合到硅基质离心吸附柱上，而其他污染物可流过膜，PCR和其他酶促反应的抑制剂可通过两步洗涤步骤被有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗  脱，即可获得高纯度DNA。纯化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文库构建、Southern Blot、分子标记等下游实验。

自备试剂：无水乙醇；提取革兰氏阳性菌需自备Enzymatic Lysis Buffer。

Enzymatic Lysis Buffer配制方法：20 mM Tris，pH8.0；2 mM Na2-EDTA，pH8.0；1.2% Triton X-100。121℃灭菌处理20分钟，加入适量的Lysozyme（溶菌酶）其终浓度为20 mg/ml。

实验前准备及重要注意事项

1. 向Proteinase K中加入1.25 ml Proteinase K Storage Buffer使其溶解，-20℃保存。配制好的Proteinase K勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。

2. 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。

3. 如果提取次生代谢产物大量积累或细胞壁厚的细菌培养物的基因组，建议在对数生  长期早期收集样品。

4. **次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。

5. 使用前请检查Buffer GTL和Buffer GL是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀出现，请将Buffer GL和Buffer GTL于56℃水浴重新溶解。

6. 如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer GL前加入4 μl DNase-Free的RNase A（100 mg/ml），RNase A本试剂盒并未提供。

如果提取样品为革兰氏阳性菌，需客户自行配制Enzymatic Lysis Buffer处理菌体，其中需使用浓度为20 mg/ml的Lysozyme（溶菌酶），Lysozyme本试剂盒并未提供。

操作步骤

ⅰ革兰氏阴性菌基因组DNA的提取

1. 取细菌培养物1-5 ml（106-108个细胞，最多不超过2×109个细胞）置于离心管（自备） 中，12,000 rpm（~13,400×g）离心1分钟，尽量吸净上清。

2. 向沉淀中加入180 μl Buffer GTL，振荡使菌体重悬。

3. 加入20 μl Proteinase  K，涡旋混匀，56℃孵育，直至溶液变清亮，孵育过程中每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样本分散。

注意：如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4 μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10分钟。

4. 加入200 μl Buffer GL，涡旋震荡充分混匀。加200 μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。

短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

注意：1）如果多个样品一起操作，Buffer GL和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入，震荡混匀。2）加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。

5. 将步骤4所得溶液（包括形成的沉淀）全部加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

6. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

7. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7。

8.12 ,000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。

9．将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200 μl Buffer GE，室温放置2-5分钟，12,000 rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。注意：1）如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。

2） 离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。

3） 用另外的50-200 μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。

4） 如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤9所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤9；若洗脱体积小于200 μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1 μg，推荐用50 μl Buffer GE或灭菌水洗脱。

5） 保存在水中的DNA会受到酸性水解作用影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。

ⅰⅰ革兰氏阳性菌基因组DNA的提取

1. 取细菌培养物1-5 ml（106-108个细胞，最多不超过2×109个细胞）置于离心管（自备） 中，12,000 rpm（~13,400×g）离心1分钟，尽量吸净上清。

2. 加入180 μl Enzymatic Lysis Buffer（自备）使菌体重悬。

Enzymatic Lysis Buffer配制方法见说明书前部分自备试剂。

3．37℃孵育30分钟。

4．加入20 μl Proteinase K涡旋震荡，充分混匀。加入200 μl Buffer GL，涡旋震荡混匀。

注意：不要把Proteinase K直接加到Buffer GL中。

5．56℃孵育30分钟。

注意：1）如果需要，95°C孵育15分钟可以使病原体失活，但是95°C孵育会造成一些DNA的降解。

2）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4 μl浓度为100 mg/ml的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10分钟。

6. 加入200 μl无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。

注意：加入无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。

7. 将步骤6所得溶液（包括形成的沉淀）全部加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DM），若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

9. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤9。

10.12,000   rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟彻底晾干。

注意：这一步目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。

11.将吸附柱置于一个新离心管（自备）中，向吸附柱中间部位悬空加入50-200 μl Buffer GE，室温放置2-5分钟，12,000    rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

注意：1）如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0时洗脱效率不高。

2） 离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。

3） 用另外的50-200 μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。

4） 如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤11所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤11； 若洗脱体积小于200 μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1 μg， 推荐用50 μl Buffer GE或灭菌水洗脱。

5） 保存在水中的DNA会受到酸性水解作用影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。