阿拉丁生产的T3 DNA Ligase，即T3 DNA连接酶，是由阿拉丁自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种来源于T3噬菌体、ATP依赖型的双链DNA连接酶。T3 DNA Ligase能够有效催化粘性末端和平末端双链DNA分子的连接以及双链DNA或DNA与RNA杂合双链的缺刻修复。缺刻修复时，完整链为DNA，缺刻链5’端和3’端’分别为DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-DNA或RNA-RNA都是可以被T3 DNA Ligase修复的，因此T3 DNA Ligase也可以用于生成DNA-RNA和RNA-DNA融合链接的核酸，以及用于基于DNA模板的RNA连接以形成较长的RNA片段。T3 DNA Ligase能够催化双链DNA中临近的5'磷酸和3'羟基之间形成磷酸二酯键，且对A/T突出末端的连接效率高于C/G末端。与T4 DNA Ligase相同，在T3 DNA Ligase反应体系中加入PEG6000可以显著提高其对平末端双链DNA的连接效率；而在缺少PEG6000的连接体系中，T3 DNA Ligase对平末端双链DNA分子的连接效率较低。另外，T3 DNA Ligase对NaCl的耐受性是T4 DNA Ligase的2倍，其在1.0M NaCl或KCl的条件下仍可保持95%的活性。因此，在涉及到高离子浓度连接的实验中，T3 DNA Ligase是理想的选择1,2]。阿拉丁生产的T3 DNA Ligase用于进行双链DNA粘性和平末端连接的效果参考图1。图1. 阿拉丁生产的T3 DNA Ligase 与N公司同类产品(Competitor)用于进行双链DNA粘性和平末端连接的效果图。图A为阿拉丁生产的或N公司(Competitor)的T3 DNA Ligase重组连接产物转化DH5α涂LB平板的实测效果图。利用阿拉丁生产的EnzymoPure™ DNA Polymerase ，使用一端带有HindIII酶切识别位点，另一端带有SmaⅠ酶切识别位点的引物对靶基因进行PCR扩增，随后使用阿拉丁HindⅢ /SmaⅠ 对1kb的PCR产物进行双酶切，获得一端带有粘性末端，另一端带有平末端的双链线性DNA分子，作为T3 DNA Ligase催化连接反应的底物。在20µl反应体系(66mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 1mM ATP, 7.5% Polyethylene glycol (PEG6000), pH7.6 @25℃)中，加入50ng经PCR扩增及HindⅢ/SmaⅠ双酶切产生的两端分别带有粘性末端和平末端的双链DNA片段，和50ng经HindⅢ/SmaⅠ双酶切线性化的pUC18载体(待插入DNA片段与pUC18载体的摩尔比为3:1)，再加入10µl的2X Reaction Buffer以及1μl的本产品或N公司(Competitor)的T3 DNA Ligase，然后用水补至20µl，25℃孵育30分钟进行连接。反应结束后，取5µl连接产物转化DH5α超级感受态细胞', "。图B为菌落PCR鉴定T3 DNA Ligase重组连接构建得到的克隆。实验结果表明，本产品与N公司的产品具有相当的连接粘性末端和平末端双链DNA的效果。菌落PCR鉴定使用的是pUC18载体的通用测序引物：M13 forward sequencing primer (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3')和M13 reverse sequencing primer (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')。本图仅供参考，实际检测效果可能有所不同。