阿拉丁生产的T7 DNA Ligase，即T7 DNA连接酶，是由阿拉丁自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种来源于T7噬菌体的、ATP依赖的双链DNA连接酶，并且对于粘性末端的连接效率远远高于平末端。与T3和T4 DNA Ligase不同，T7 DNA Ligase仅可催化双链DNA相邻粘性末端5'磷酸和3'羟基磷酸二酯键的形成，但不能有效催化平末端双链DNA的连接，加入大于或等于20%的PEG6000可以适当提高该酶的平末端DNA连接活性。因此在平末端和粘性末端双链DNA底物同时存在，且仅需连接粘性末端双链DNA的分子生物学实验中，T7 DNA Ligase是理想的选择1,2]。阿拉丁生产的T7 DNA Ligase用于进行双链DNA粘性末端连接的效果参考图1。图1. 阿拉丁生产的T7 DNA Ligase用于进行双链DNA粘性末端连接的效果图。A. 阿拉丁生产的T7 DNA Ligase与N公司(Competitor)催化产生的重组连接产物转化DH5α感受态后涂LB平板的实测效果图。利用阿拉丁生产的EnzymoPure™ DNA Polymerase ，使用一端带有Hind III酶切识别位点，另一端带有Xba Ⅰ酶切识别位点的引物对靶基因进行PCR扩增，随后使用阿拉丁Hind Ⅲ / Xba Ⅰ对1kb的PCR产物进行双酶切，获得两端带有粘性末端的双链线性DNA分子，作为T7 DNA Ligase催化连接反应的底物。在20µl反应体系(66mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 1mM ATP, 7.5% Polyethylene glycol (PEG6000), PH7.6 @25℃)中，分别加入50ng经PCR扩增及Hind Ⅲ/Xba Ⅰ双酶切产生的两端带有粘性末端的双链DNA片段，和经Hind Ⅲ/Xba Ⅰ双酶切线性化的pUC18载体混合(PCR片段与pUC18载体的摩尔比为3:1)，加入10µl的2X Reaction Buffer以及1μl的本产品或N公司(Competitor)的T7 DNA Ligase，然后用水补至20µl，25℃孵育30分钟进行连接。反应结束后，取5µl连接产物转化DH5α超级感受态细胞。B. 菌落PCR鉴定T7 DNA Ligase重组连接构建得到的克隆。实验结果表明，本产品与N公司的产品克隆阳性率一致，具有相当的连接粘性末端双链线性DNA的效果。菌落PCR使用的是pUC18的通用测序引物M13 forward sequencing primer(5´-GTAAAACGACGGCCAGT-3´)和M13 reverse sequencing primer (5´-CAGGAAACAGCTATGAC-3´)。本图仅供参考，实际检测效果可能有所不同。