HiFi II M-MLV(H-)是经过突变的M-MLV基因利用大肠杆菌工程菌进行重组与表达的 逆转录酶，该酶能够催化以RNA或DNA：RNA杂交链为模板的互补DNA聚合反应。经 过突变的HiFi II M-MLV(H-)逆转录酶RNase H活性缺失，减少了逆转录反应中RNA的降 解，更容易获得全长的cDNA。HiFi II M-MLV(H-)逆转录酶能在55℃合成**条链 cDNA，提供更高的特异性，稳定性强，可以合成最大12 kb的cDNA，cDNA产量高。 适用于**链cDNA的合成、RT-PCR、RT-qPCR以及全长cDNA文库的构建等。

活性定义：

以Poly（A）为模板，oligo（dT）为引物，在37℃条件下，10分钟内催化掺入1 nmol的dTTP所需酶量定义为一个活性单位(U)。 

质量控制：

200 U的本酶和1 µg的16 S，23 S rRNA在37℃下反应1小时，RNA的电泳谱带不 发生变化。  

注意事项：

1．在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门 的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经 常更换手套。 

2．实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙 酯）水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃 器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC 处理后进行高压灭菌。

3．本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心 后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。 

4．若起始RNA的量小于50 ng，建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提供。

使用方法：

注意：10 ng-5 μg总RNA可建立20 μL反应体系，如果总RNA量大于5 μg，请按比例扩大反应体系。

i 逆转录操作步骤： 

1．将RNA模板、引物、dNTP Mix、SuperRT Buffer、HiFi II M-MLV(H-)和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。 

2．根据以下表格配制反应体系，总体积为20 μL。  

注意：若起始RNA的量小于50ng，则建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提供。

3．涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 

4．55℃孵育1-30分钟，85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。 

5．逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。

ii 若逆转录效率低，或RNA模板二级结构复杂、GC含量高时，建议采用以下步骤： 

1．将RNA模板、引物、dNTP Mix、SuperRT Buffer、HiFi II M-MLV(H-)和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。

2．根据以下表格配制反应体系，总体积为15 μL 。  

3. 70℃孵育10分钟，迅速冰浴2分钟。 

4. 短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 

5. 向以上反应液中加入4 μL 5×SuperRT Buffer。

注意：若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂(RNasin)。本试剂盒并未提供。 

6. 轻轻吹打混匀，若反转录引物为Oligo-dT Primer或Specific Primer时， 

7. 42℃孵育2 分 钟；若反转录引物为Random Primers，则25℃孵育10分钟。

8. 加入1 μL HiFi II M-MLV(H-) (200 U/μL)，轻轻吸打混匀。 55℃孵育50分钟。 85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。 

9. 逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。  

HiFi II M-MLV (H -) is a reverse transcriptase that recombines and expresses mutated M-MLV genes using E. coli engineering bacteria. This enzyme can catalyze complementary DNA polymerization reactions using RNA or DNA: RNA hybrid strands as templates. The mutated HiFi II M-MLV (H -) reverse transcriptase RNase H activity is missing, reducing RNA degradation in reverse transcription reactions and making it easier to obtain full-length cDNA. HiFi II M-MLV (H -) reverse transcriptase can synthesize the first strand of cDNA at 55 ℃, providing higher specificity, strong stability, and can synthesize up to 12 kb of cDNA with high cDNA yield. Suitable for the synthesis of first stranded cDNA, RT PCR, RT qPCR, and construction of full-length cDNA libraries.