本产品是专为两步法RT-PCR**步实验配制的cDNA**链合成试剂盒。本产品包 含从RNA模板逆转录成cDNA**链所需的所有试剂，其中包括HiFi-MMLV逆转录酶、 反应缓冲液、引物、dNTP等。经过突变改造的HiFi-MMLV逆转录酶RNase H活性缺失， 减少了逆转录反应中RNA的降解，更容易获得全长的cDNA。HiFi-MMLV逆转录酶热稳 定性强，可得高产量的cDNA，使用简单方便。本系统对后续的PCR以及定量PCR试 验兼容性高，适用各种PCR反应的DNA聚合酶。 | H665693 | Component | 100 T | Storage | | H665693A | HiFi-MMLV, 200 U/μL | 100 μL | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | H665693B | 5×RT Buffer | 500 μL | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | H665693C | Primer Mix | 240 μL | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | H665693D | dNTP Mix, 2.5 mM Each | 500 μL | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | H665693E | DTT, 0.1 M | 240 μL | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. | | H665693F | RNase-Free Water | 1 mL | -20℃. Avoid freeze/thaw cycle. |
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产品特点： ·RNase H-：经突变的HiFi-MMLV逆转录酶，RNase H活性缺失，更易获得全长cDNA。 ·使用方便：试剂盒包含除RNA模板外的逆转录所需全部试剂。 注意事项： 1．在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门 的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经 常更换手套。 2．实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙 酯）水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃 器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC 处理后进行高压灭菌。 3．本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心 后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。 4．若起始RNA的量小于50 ng，建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提供。 使用方法： 注意：10 ng-5 μg总RNA可建立20 μl反应体系，如果总RNA量大于5 μg，请按比例扩大反应体系 i 逆转录操作步骤： 1．将RNA模板、引物、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和RNase-Free Water 溶解并置于冰上备用。 2．根据以下表格配制反应体系，总体积为20 μl。 | 试剂 | 20 μl反应体系 | 终浓度 | | dNTP Mix，2.5 mM Each | 4 μl | 500 μM Each | | Primer Mix | 2 μl | / | | RNA Template | X μl | 1 ng-5 µg | | 5×RT Buffer | 4 μl | 1× | | DTT，0.1 M | 2 μl | 10 mM | | HiFi-MMLV，200 U/μl | 1 μl | / | | RNase-Free Water | up to 20 μl | / |
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注意： 1）若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提供。 2）Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配制而成. 3．涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 4．42℃孵育30-50分钟，85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。 5．逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。 ii 若逆转录效率低，或RNA模板二级结构复杂、GC含量高时，建议采用以下步骤： 1．将RNA模板、引物、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和RNase-Free Water 溶解并置于冰上备用。 2．根据以下表格配制反应体系，总体积为13 μl 。 | 试剂 | 20 μl反应体系 | 终浓度 | | dNTP Mix，2.5 mM Each | 4 μl | 500 μM Each | | Primer Mix | 2 μl | / | | RNA Template | X μl | 1 ng-5 µg | | RNase-Free Water | up to 13 μl | / |
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3．70℃孵育10分钟，迅速冰浴2分钟。
4．短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
5．继续向以上反应液中加入以下试剂：
| 试剂 | 20 μl反应体系 | 终浓度 | | 5×RT Buffer | 4 μl | 1× | | DTT，0.1 M | 2 μl | 10 mM | | HiFi-MMLV，200 U/μl | 1 μl | / |
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注意：
1）若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提供。
2）Primer Mix由Oligo（dT）和Random primer配制而成。
6．轻轻吹打混匀，42℃孵育50分钟，85℃孵育5分钟。
7．反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
8．逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。 | 
